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將純化的西瓜花葉病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)制劑免疫BALB/c小鼠,用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)西瓜花葉病毒免疫的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞融合,有限稀釋法克隆和間接ELISA法篩選出1株穩(wěn)定分泌西瓜花葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株6C6。用間接ELISA方法對(duì)所獲得的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行亞型鑒定為IgG1。間接ELISA方法測(cè)定腹水效價(jià)為1∶105。
以單克隆抗體為包被抗體、多克隆抗體為檢測(cè)抗體的TAS-ELISA試劑盒與引自ATCC的西瓜花葉病毒毒源PV-27、PV-379、PV-394、PV-511分離物均有反應(yīng),與同屬的馬鈴薯A病毒(Potato virus A)、萵苣花葉病毒(Lettuce mosaicvirus virus)、李痘病毒(Plum pox virus)不發(fā)生交叉反應(yīng),與同屬的番木瓜環(huán)斑病毒呈弱陽(yáng)性反應(yīng)口蹄疫(Foot and Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的以感染偶蹄動(dòng)物為主的急性、熱性、高度傳染性疫病。該病的發(fā)生和流行嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須通報(bào)的多種動(dòng)物共患傳染病之一。細(xì)胞
從2005年起國(guó)內(nèi)不斷發(fā)生牛口蹄疫,目前面臨著Asia 1型口蹄疫的持續(xù)危害、O型FMDV的復(fù)發(fā)感染、新型毒株A型的侵襲風(fēng)險(xiǎn)。因此,國(guó)內(nèi)口蹄疫的防控任務(wù)艱巨。我國(guó)防控FMD主要采取疫苗免疫和抗體監(jiān)測(cè)為主的綜合防控政策,通過(guò)接種疫苗提高畜群整體抗體水平來(lái)預(yù)防口蹄疫的感染和傳播。因此牛口蹄疫感染的快速診斷、免疫效果評(píng)價(jià)、自然感染和疫苗免疫的鑒別診斷成為防控口蹄疫的關(guān)鍵技術(shù)。
本研究通過(guò)pPROEXTM HTb表達(dá)載體在大腸桿菌DH5α中成功表達(dá)了FMDV的vp2基因,獲得大小為35ku的融合蛋白,Western blot證實(shí)目的蛋白可與FMDV 5種血清型的牛陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。以此純化蛋白為抗原建立了牛FMDV VP2蛋白間接ELISA方法。特異性試驗(yàn)表明,該抗原不與常見(jiàn)的7種牛病陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。檢測(cè)非免疫無(wú)口蹄疫地區(qū)牛陰性血清特異性為100%;檢測(cè)感染血清敏感性為97.3%;與4種商品化試劑盒比較檢測(cè)O-Asia 1二價(jià)滅活苗免疫牛血清364份,符合率分別為69.0%、95.0%、90.4%和86.8%。試驗(yàn)結(jié)果表明建立的ELISA方法可用于牛口蹄疫感染和免疫抗體檢測(cè)。本研究利用實(shí)驗(yàn)室融合表達(dá)的3B表位串聯(lián)肽(8BF)為檢測(cè)抗原建立的間接ELISA為基礎(chǔ),優(yōu)化組裝了一種特異、敏感的間接ELISA試劑盒。
通過(guò)檢測(cè)大量未免疫、免疫健康牛血清和感染牛血清,確定了判定標(biāo)準(zhǔn):S/P≥0.3,陽(yáng)性;0.2≤S/P<0.3,可疑;S/P<0.2,陰性。8BF-ELISA試劑盒檢測(cè)NSP抗體持續(xù)期試驗(yàn)表明,自然感染牛3B表位肽感染后10個(gè)月仍為陽(yáng)性。與3種商品化試劑盒比較檢測(cè)101份臨床樣本,和Ceditest? FMDV-NS ELISA、3ABC-I-ELISA符合率高達(dá)95%;與3ABC-I-ELISA進(jìn)一步比較檢測(cè)528份不同背景的牛血清,總符合率為94.5%(499/528)。大規(guī)模檢測(cè)不同來(lái)源的6個(gè)牛場(chǎng)共2026份臨床牛血清,部分牛群全部陰性,大多數(shù)牛群含有陽(yáng)性牛,陽(yáng)性率從3%到17%不等,個(gè)別感染牛群陽(yáng)性率高達(dá)72.2%。8BF-ELISA試劑盒方便、安全、實(shí)用,特異性和敏感性高,用于鑒別診斷牛FMD自然感染和疫苗免疫,為FMD綜合防控提供了。細(xì)胞
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